生体調節機能研究

メンバー

リーダー 研究副部長　大澤 郁朗
研究員 藤田 泰典、池谷 真澄
非常勤研究員 伊藤 雅史

キーワード

水素分子、水素ガス、水素水、疾患予防・治療、ミトコンドリア、ミトホルミシス、複製老化、老化マーカー、GDF15

主な研究

＜水素分子医学＞
1. 水素ガスの吸入による新たな疾患治療法の確立
2. 水素水飲用による疾患及び老化抑制効果の検証
3. 生体における水素分子の作用メカニズム解明

＜ミトコンドリアと老化＞
4. ミトコンドリアクリステの形態変化
5. 分裂老化のミトコンドリア制御
6. 老化マーカーとしてのGDF15

研究紹介

水素分子医学

分子状水素（H2）は無色無臭の気体として存在する最も軽い分子です。酸素と混合して着火すると激しく燃焼し水を生成しますが、常温常圧では反応性の低い安定な分子です。ヒトの呼気ガス中に体積比で数ppmから100 ppmほどのH2が含まれていますが、これは腸内細菌群が産生したもので、ヒドロゲナーゼによるプロトン還元反応の産物です。この酵素は逆にH2を酸化して電子を供与することができます。しかし、脊椎動物などの高等生物はヒドロゲナーゼを持たないため、H2はヘリウムや窒素などの不活性気体と同様に考えられてきました。これに対し、当テーマの大澤らはH2が酸化ストレスを制御することで脳梗塞などの疾患治療に応用できることを2007年にNature Medicine誌で発表しました。以降、H2の医学応用に向けた多様な研究が飛躍的に増加しています。私たちはH2ガスやH2を高度に含有する水素水を用いた疾患動物モデルでの研究から、トランスレーショナル・リサーチとして多くの医療機関と連携した臨床研究を進めています。また、H2の生理的な作用メカニズム解明を目指して、分子レベル、細胞レベルの研究に取り組んでいます。

　水素ガスの吸入による新たな疾患治療法の確立

　水素ガス吸入療法では1から4%程度のH2をブレンドしたガスを吸入させることで急性期の炎症反応抑制効果が期待されています。脳梗塞のラットモデルでは、虚血再灌流の間に2%のH2ガスを麻酔ガスと混合して吸入させることで脳細胞死を抑制することができます。その効果は既存薬のエダラボンよりも顕著でした。この結果を受けて脳梗塞患者の治療や心肺停止からの蘇生後脳症に対する治療などのヒトでの臨床研究が進められています。また、マウスのブレオマイシン投与による急性呼吸促迫症候群モデルでは1日に6時間、3.2%のH2ガスを吸入させることで肺繊維化が抑制されました。この時、IL-6などの炎症性サイトカイン上昇が抑制され、M2マクロファージ（Iba1+, CD163+）の浸潤も抑制されていました。H2ガスの吸入で血管炎や感染症、薬物投与などで生じるサイトカインストームが効果的に抑制されるものと期待しています。
　ヒトについては2021年から水素ガス吸入による抗炎症効果を元にした臨床研究を当センターで始めています。対象は大動脈解離（Stanford B型）の患者さんで、ICUにて2%の水素ガスを吸入していただいています。

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　水素水飲用による疾患及び老化抑制効果の検証

　近年、水素水飲用による抗疲労効果のヒトでの試験結果が内外から多数報告されています。水素水は高濃度のH2ガスを一過的かつ安全に取り込む方法として普及されてきました。私たちの研究室では、水素水飲用による疾患及び老化の抑制効果について動物モデルを中心に検証しています。
　抗がん剤ゲフィチニブはEGFレセプターのチロシンキナーゼを選択的に阻害することで肺がんを抑制しますが、喫煙者などが服用すると重篤な副作用が生じます。そこで、ナフタレンで肺に炎症を起こしたマウスにゲフィチニブを投与し、水素水を自由飲用させました。すると生存率が上がり、肺の病理所見が改善され、炎症性サイトカインの発現と肺胞洗浄液中の炎症細胞数の上昇も共に抑制されました。同様の水素水による抗がん剤副作用抑制効果はシスプラチンを投与したマウスの腎臓でも確認しています。尚、これらの薬剤の抗がん作用を水素水が阻害することはありませんでした。
　水素水をアテローム性動脈硬化症のモデル動物であるApoEノックアウトマウスに自由飲用させるとアテロームの蓄積が抑制されることを2008年に報告しました。さらに私たちは、同じく動脈硬化症モデルであるLdlrノックアウトマウスに高脂肪食を与えてアテロームの形成を誘導し、水素水と老化細胞除去薬であるナビトクラックスの効果を比べてみました。すると大動脈でのマクロファージ蓄積と老化細胞マーカーであるp16及びp21の発現がナビトクラックスと同等に水素水の飲用で抑制されており、血管老化の抑制に水素水が有効である可能性を示すことができました。この時、水素水の飲用が血中のコレステロールやLDLの上昇を抑えることはなく、脂質代謝への影響はありませんでした。一方で、マクロファージの泡沫化・老化を促進するCD36の発現が抑制されていました。私たちは、培養細胞でH2がCD36の発現抑制を抑制することを報告していましたので、これがH2による老化抑制の鍵となるものと考えています。
　この水素水の飲用では、疾患予防効果があることをリポポリサッカライド（LPS）を投与した敗血症のモデルマウスで確認しています。実験では投与前の３日間だけ水素水を自由飲用させ、LPS投与後には普通の水に戻しています。それでも生存率は上昇し、肝機能の低下が抑制されました。これは水素水の事前飲用で肝臓の抗酸化酵素ヘムオキシゲナーゼ-1が効率よく誘導された結果です。動物モデルを用いた水素水の事前飲用効果はビタミンCを欠損させたSMP30ノックアウトマウスやMPTP投与によるパーキンソン病のモデルマウスでも確認されており、事前の水素水飲用は抗炎症及び抗酸化ストレス効果をもたらすと考えています。

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　生体における水素分子の作用メカニズム解明

　私たちはH2の作用メカニズム解明に向けた研究を続けています。H2は最も反応性の高い活性酸素種であるヒドロキシルラジカルと反応することから、当初は主に還元物質としてのH2に着目していました。実際、H2存在下では放射線照射や超音波により発生するヒドロキシルラジカルが減少することを報告しています。特に眼科手術に用いる眼灌流液はヒドロキシルラジカルとの反応性がH2よりも３桁ほど高いグルタチオンを大量に含有しているのですが、それでもH2を添加すると超音波によるヒドロキシルラジカルが減少します。白内障超音波乳化吸引術では超音波による角膜の破砕が行われます。この時に発生するヒドロキシルラジカルが角膜内皮を障害するのですが、H2含有眼灌流液がこれを緩和することを動物モデルで示しました。さらに白内障を患う高齢者を対象とした臨床研究でもH2含有眼灌流液の効果を確かめています。
　一方で、通常の生理的条件下ではヒドロキシルラジカルなどの反応性が高い活性酸素種／ラジカルの高度な発生は認められません。そこで、ヒト神経芽細胞SH-SY5YをH2存在下で培養し、過酸化水素による酸化ストレス障害を与えたところ、事前にH2存在下で培養した場合のみ細胞死が抑制されました。過酸化水素添加後にH2存在下で培養しても効果はありませんでした。これは過酸化水素により生じるヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種をH2が直接的に還元することで細胞障害が抑制されている可能性は極めて小さいことを意味します。事前にH2存在下で培養した細胞ではミトコンドリアに由来する活性酸素種が僅かに増加し、ストレス応答性転写因子Nrf2の核移行と下流の抗酸化酵素類の発現誘導が観察されました。H2の添加によりミトコンドリアを介した細胞の適応応答であるミトホルミシスが誘導されとことを示しています。さらに生体膜とH2の親和性からLC-MS/MSを用いて脂質を解析したところ、ホスファチジルイノシトールやカルジオリピンなどのリン脂質が一過的に上昇していました。リン脂質の変動に強く連関するエンドサイトーシスやエネルギー代謝も一過的に抑制されたことから、これらの変化がミトホルミシスを引き起こす細胞内ストレスとなっていると推測されます。現在、さらにH2が直接作用する分子の同定を試みています。

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ミトコンドリアと老化

「命」とは何か、生命科学の基礎研究を進める過程で、医学分野に貢献する新しい発見や技術が生まれます。分子状水素医学の端緒はミトコンドリアの酸化ストレス制御に関する研究です。ミトコンドリアは外膜と内膜で包まれた真核細胞内小器官であり、細胞のエネルギーであるATPを生産します。クエン酸回路や電子伝達系を内包し、酸素を用いたATP産生を司っています。電子伝達系は内膜が貫入したクリステと呼ばれるひだ状の構造体の上に高密度で存在します。このミトコンドリアの働きが活発だとATPが大量に生産され、脳や筋組織などを健常な状態に保つことができます。一方、電子が伝達される過程で一部が漏れ出し、酸素と結びついて活性酸素となり、さらには核ゲノムを攻撃することで細胞にダメージを与えることが、多くの疾患や老化の促進に寄与しているものと考えることができます。ミトコンドリアを研究することは、なぜ老化するのかという根本的な疑問を解決するための研究なのです。

　ミトコンドリアクリステの形態変化

　クリステの形態については、しばしば電子顕微鏡画像などを元にデフォルメしたイラストを見かけるので、ほとんどの人は梯子状の単純化された形状を想像します。しかし、超微細構造の研究から提案された形態は、シンプルなチューブ状構造から複雑なドレープ様のラメラ状構造まで実に様々です。また、クリステの配置や数、表面積は、細胞の種類や生理状態によっても大きく変化することが知られています。クリステ形成はどのように進行するのか、形成されたクリステはその形状を保っているのか、ミトコンドリアの分裂・融合時にクリステはどうなるのか、多数の疑問があります。しかし、生細胞でクリステを観察することは容易でありません。哺乳類培養細胞におけるミトコンドリアの直径はおよそ500 nm程度であり、その内部構造であるクリステは通常の光学顕微鏡で観察できる回折限界（およそ200 nm）を大きく下回っているからです。
　私たちは生細胞をミトコンドリア特異的蛍光色素で染色し、STED顕微鏡を用いてクリステの構造変化を観察しています。STED顕微鏡では励起用レーザー光の焦点にドーナツ状の誘導放出用レーザー光（STED光）を重ね、ドーナツの中心部分に残る励起用レーザー光による蛍光スポットのみを検出します。この方法により50 nm程度の解像度で細胞内を経時的に観察することができます。正常細胞ミトコンドリアでは単軸方向を線で結んだ階段状のクリステが多数観察されます。しかし、その形態は一様ではなく、単軸方向を端から端まで繋ぐ長いものから、顆粒状に見える短いもの、屈曲しているものや分岐しているものまであります。また、クリステの間隔も狭いところから比較的広いところまであります。ミトコンドリアDNAの塩基番号3243に点突然変異を持つミトコンドリア病細胞では、ミトコンドリア内部にオニオンスライス状の構造や大きく膨張したクリステが観察され、その合間には正常ミトコンドリアで見られるような梯子構造のクリステも存在していました。私たちはクリステ膜自体の秒単位の変化を観察するためにヒト肺上皮由来のA549細胞をミトコンドリア膜電位依存性色素であるTMRMで染色し、STEDでクリステを可視化しました。0.72秒間に1コマで約20秒間観察したところ、ミトコンドリア自体の動きを上回る変化で、ミトコンドリアに対して相対的に一部のクリステが大きく動いている様子を観察できました。ミトコンドリアはブラウン運動により小さく振動していますが、これが内部で増幅されてクリステがより大きく振動しているものと推察されます。

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　分裂老化のミトコンドリア制御

　細胞老化は分裂細胞が不可逆的に増殖を停止した状態で、1960年代にHayflickによりはじめて報告されました。胎児から摘出した細胞を培養し続けると、やがて細胞は特徴的な形態を示しながら増殖を停止することから、細胞分裂の回数には限界があることが示されたのです。この現象は「複製老化（replicative senescence）」と呼ばれています。これとは別にがん遺伝子変異の導入や、DNAダメージ、酸化ストレス等によっても細胞老化が引き起こされ、まとめて「早期細胞老化（premature senescence）」と呼ばれています。多くの研究からミトコンドリア機能障害は早期細胞老化を引き起こし、あるいは促進することが知られています。一方で、ミトコンドリア機能を抑制すると複製老化の進行が遅くなるなど、複製老化とミトコンドリア機能との関連についてはさらに研究が必要です。そこで、40年前に当研究所で樹立された複製老化研究用細胞株であるヒト胎児由来線維芽細胞TIG-1を用いて、複製老化前後のミトコンドリアを解析しています。複製老化後にはミトコンドリア分裂関連因子の発現抑制によって細く長くなったミトコンドリアが観察されます。ミトコンドリア内部については、クリステ構造などに大きな変化は見られませんでした。これは複製老化の過程でミトコンドリア機能自体に大きな変化が無いことを示唆しています。実際、複製老化の進行中に呼吸鎖機能低下や活性酸素種の増大といったミトコンドリア機能異常は観察されませんでした。一連の観察結果から、私たちは複製老化に先立ってミトコンドリアに異常が起きることはないと考えています。

　老化マーカーとしてのGDF15

　ミトコンドリア病はエネルギー需要の高い脳、骨格筋、心筋で症状が現れるだけでなく、様々な臓器で多様な臨床症状を示します。症状が現れた組織ではミトコンドリア機能障害に伴うATP産生の低下により解糖系が亢進し、乳酸が過剰に産生されます。このため、血中の乳酸/ピルビン酸比はミトコンドリア機能障害を評価するマーカーとして臨床で利用されてきました。 しかし、臨床症状と相関しないケースも多く、より精度の高い診断マーカーが求められてきました。当研究テーマの藤田らはミトコンドリア病細胞のトランスクリプトームおよびメタボローム解析から、正常細胞に比して顕著に発現が増大するGDF15を同定し、これがミトコンドリア病の診断、治療効果の判定に有用なバイオマーカーであることを示しました。GDF15はTGF-βスーパーファミリーに属する分泌タンパクで、前立腺、腸、腎臓、脈絡叢、胎盤などで高発現しています。また、低酸素、炎症、UV曝露、組織傷害などのストレスに応答してGDF15の遺伝子発現が誘導されます。 近年、高齢者の血中 GDF15 濃度が将来の総死亡の予測因子となることが報告されました。しかし、身体機能、栄養状態、心理・社会的機能などの交絡要因を調整した上での、血中GDF15濃度と総死亡の独立した関連性は明らかにされていません。そこで地域在住高齢者1832人を対象に、血中GDF15濃度と各要因の横断的な関連性および将来の総死亡との関連性を調査しました。その結果、血中GDF15濃度が高いほど身体機能は低く、炎症マーカーも高いことがわかりました。さらに血中GDF15濃度が最高値群は最低値群と比べて将来の総死亡リスクが約２倍高くなっていました。

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主要文献、著書

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  4. 大澤郁朗、堀内かほる. 超解像STED顕微鏡を用いたクリステのライブイメージング.　ミトコンドリアダイナミクス〜機能研究から疾患・老化まで〜 エヌ・ティー・エス. 2021年, 第1編:p177-186.
  5. 藤田泰典. ミトコンドリア病診断マーカーGDF15の開発. ミトコンドリアダイナミクス〜機能研究から疾患・老化まで〜　エヌ・ティー・エス. 2021年, 第2編:p257-264.
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  16. 大澤郁朗．分子状水素による認知症を含む神経疾患予防の可能性. 神経治療 2020;37(3):1-4.
  17. 大澤郁朗. HPV遺伝子検査. 三石 剛・渡辺大輔編著「目からウロコの疣贅診療ハンドブック」 南向堂 2020年6月, p98-103.
  18. Edo N, Kawakami K, Fujita Y, Morita K, Uno K, Tsukamoto K, Onose H, Ishikawa T, Ito M. Exosomes Expressing Thyrotropin Receptor Attenuate Autoantibody-Mediated Stimulation of Cyclic Adenosine Monophosphate Production. Thyroid. 2019;29:1012-1017.
  19. Mizutani K, Kawakami K, Horie K, Fujita Y, Kameyama K, Kato T, Nakane K, Tsuchiya T, Yasuda M, Masunaga K, Kasuya Y, Masuda Y, Deguchi T, Koie T, Ito M. Urinary exosome as a potential biomarker for urinary tract infection. Cell Microbiol 2019;21:e13020.
  20. Mizutani K, Horie K, Kato T, Nakane K, Kawakami K, Fujita Y, Ito M. Serum PD-1 levels measured by ELISA using Nivolumab increased in advanced RCC patients: novel approach to develop companion diagnostics for antibody therapy. J Cancer Res Clin Oncol 2019;145:1661-1663.
  21. Terasaki Y, Terasaki M, Kanazawa S, Kokuho N, Urushiyama H, Kajimoto Y, Kunugi S, Maruyama M, Akimoto T, Miura Y, Igarashi T, Ohsawa I, Shimizu A. Effect of H2 treatment in a mouse model of rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease. J Cell Mol Med. 2019;23(10):7043-7053.
  22. Fukutani Y, Tamaki R, Inoue R, Koshizawa T, Sakashita S, Ikegami K, Ohsawa I, Matsunami H, Yohda M. The N-terminal region of RTP1S plays important roles in dimer formation and odorant receptor-trafficking. J Biol Chem. 2019;294(40):14661-14673.
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  34. 新開省二、大澤郁朗、石神昭人、伊藤雅史、金憲経、青栁幸利、清野諭、横山友里．パンフレット：健康食品やサプリメントの利用の目安（社会保険出版社）2017年.
  35. 高橋眞由美．健康長寿に向けたアンチエイジングにおけるコエンザイムQの役割.　「パトス」（ポリッシュ・ワーク）2017年.
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